พีซีอาร์คือปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ซึ่งหมายถึงการเติม dNTP, Mg2+, ปัจจัยการยืดตัว และปัจจัยการเพิ่มประสิทธิภาพการขยายสัญญาณให้กับระบบภายใต้การเร่งปฏิกิริยาของ DNA โพลีเมอเรส โดยใช้ DNA ต้นกำเนิดเป็นเทมเพลตและไพรเมอร์เฉพาะเป็นจุดเริ่มต้นของการขยาย ด้วยขั้นตอนของการเสียสภาพ การหลอม การขยาย ฯลฯ กระบวนการของการจำลอง DNA ของสายลูกสาว ในหลอดทดลอง ซึ่งเสริมกับ DNA เทมเพลตของสายต้นกำเนิดสามารถขยาย DNA เป้าหมายใดๆ ในหลอดทดลอง ได้อย่างรวดเร็วและเฉพาะเจาะจง
1. PCR แบบฮอตสตาร์ท
เวลาเริ่มต้นของการขยายสัญญาณใน PCR แบบเดิมไม่ใช่การใส่เครื่อง PCR เข้าไปในเครื่อง PCR จากนั้นโปรแกรมจะเริ่มขยายสัญญาณเมื่อการกำหนดค่าระบบเสร็จสมบูรณ์ การขยายสัญญาณจะเริ่มต้นขึ้น ซึ่งอาจทำให้เกิดการขยายสัญญาณที่ไม่เฉพาะเจาะจง และ PCR แบบ hot-start สามารถแก้ปัญหานี้ได้
PCR แบบเริ่มร้อนคืออะไร?หลังจากเตรียมระบบปฏิกิริยาแล้ว ตัวดัดแปลงเอนไซม์จะถูกปล่อยออกมาที่อุณหภูมิสูง (โดยปกติจะสูงกว่า 90°C) ในระหว่างขั้นตอนการให้ความร้อนเริ่มต้นของปฏิกิริยาหรือระยะ "การเริ่มร้อน" เพื่อให้ DNA polymerase ถูกกระตุ้นเวลาและอุณหภูมิในการกระตุ้นที่แน่นอนขึ้นอยู่กับลักษณะของ DNA polymerase และตัวดัดแปลง hot-startวิธีนี้ใช้ตัวดัดแปลงเป็นหลัก เช่น แอนติบอดี ลิแกนด์ที่มีสัมพรรคภาพ หรือตัวดัดแปลงทางเคมี เพื่อยับยั้งการทำงานของ DNA polymeraseเนื่องจากกิจกรรมของ DNA polymerase ถูกยับยั้งที่อุณหภูมิห้อง เทคโนโลยีการสตาร์ทแบบร้อนจึงให้ความสะดวกสบายอย่างมากในการเตรียมระบบปฏิกิริยา PCR หลายระบบที่อุณหภูมิห้อง โดยไม่กระทบต่อความจำเพาะของปฏิกิริยา PCR
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) เป็นเทคนิคทดลองสำหรับการถอดรหัสแบบย้อนกลับจาก mRNA ไปเป็น cDNA และใช้เป็นเทมเพลตสำหรับการขยายสัญญาณขั้นตอนการทดลองคือการแยก RNA ทั้งหมดในเนื้อเยื่อหรือเซลล์ก่อน ใช้ Oligo (dT) เป็นไพรเมอร์ ใช้ Reverse transcriptase เพื่อสังเคราะห์ cDNA จากนั้นใช้ cDNA เป็นเทมเพลตสำหรับการขยาย PCR เพื่อให้ได้ยีนเป้าหมายหรือตรวจจับการแสดงออกของยีน
3. PCR เชิงปริมาณเรืองแสง
PCR เชิงปริมาณฟลูออเรสเซนต์ (PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์,RT-qPCR) หมายถึงวิธีการเพิ่มกลุ่มฟลูออเรสเซนต์ในระบบปฏิกิริยา PCR โดยใช้การสะสมของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์เพื่อติดตามกระบวนการ PCR ทั้งหมดแบบเรียลไทม์ และสุดท้ายคือการใช้เส้นโค้งมาตรฐานเพื่อวิเคราะห์เทมเพลตในเชิงปริมาณวิธี qPCR ที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ SYBR Green I และ TaqMan
4. PCR ที่ซ้อนกัน
Nested PCR หมายถึงการใช้ไพรเมอร์ PCR สองชุดสำหรับการขยาย PCR สองรอบ และผลิตภัณฑ์การขยายของรอบที่สองคือส่วนของยีนเป้าหมาย
หากความไม่ตรงกันของไพรเมอร์คู่แรก (ไพรเมอร์ตัวนอก) ที่ไม่ตรงกันทำให้ผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงถูกขยาย ความเป็นไปได้ที่ไพรเมอร์คู่ที่สองจะรับรู้ถึงภูมิภาคที่ไม่เฉพาะเจาะจงและขยายอย่างต่อเนื่องนั้นมีน้อยมาก ดังนั้น การขยายด้วยไพรเมอร์คู่ที่สอง ความจำเพาะของ PCR ได้รับการปรับปรุงแล้วข้อดีอย่างหนึ่งของการทำ PCR สองรอบคือช่วยขยายผลิตภัณฑ์ให้เพียงพอจาก DNA เริ่มต้นที่มีจำกัด
5. PCR แบบทัชดาวน์
Touchdown PCR เป็นวิธีการปรับปรุงความจำเพาะของปฏิกิริยา PCR โดยการปรับพารามิเตอร์รอบ PCR
ใน PCR แบบทัชดาวน์ อุณหภูมิการอบอ่อนสำหรับสองสามรอบแรกจะถูกตั้งค่าให้สูงกว่าอุณหภูมิการอบอ่อนสูงสุด (Tm) ของไพรเมอร์สองสามองศาอุณหภูมิการหลอมที่สูงขึ้นสามารถลดการขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงได้อย่างมีประสิทธิภาพ แต่ในเวลาเดียวกัน อุณหภูมิการหลอมที่สูงขึ้นจะทำให้การแยกไพรเมอร์และลำดับเป้าหมายรุนแรงขึ้น ส่งผลให้ผลผลิต PCR ลดลงดังนั้นในสองสามรอบแรก โดยปกติอุณหภูมิการหลอมจะถูกตั้งค่าให้ลดลง 1°C ต่อรอบเพื่อเพิ่มเนื้อหาของยีนเป้าหมายในระบบเมื่ออุณหภูมิการอบอ่อนลดลงจนถึงอุณหภูมิที่เหมาะสม อุณหภูมิการอบอ่อนจะคงอยู่ตลอดรอบที่เหลือ
6. PCR โดยตรง
Direct PCR หมายถึงการขยาย DNA เป้าหมายโดยตรงจากตัวอย่าง โดยไม่จำเป็นต้องแยกกรดนิวคลีอิกและทำให้บริสุทธิ์
PCR โดยตรงมีสองประเภท:
วิธีการโดยตรง: นำตัวอย่างจำนวนเล็กน้อยแล้วเติมลงใน PCR Master Mix โดยตรงเพื่อระบุ PCR
วิธีการแคร็ก: หลังจากการสุ่มตัวอย่างแล้ว ให้เพิ่มลงในไลซีน ไลซีนเพื่อปล่อยจีโนม ใช้ส่วนลอยเหนือตะกอน lysed จำนวนเล็กน้อยแล้วเติมลงใน PCR Master Mix จากนั้นดำเนินการระบุ PCRแนวทางนี้ทำให้ขั้นตอนการทดลองง่ายขึ้น ลดเวลาลงมือจริง และหลีกเลี่ยงการสูญเสีย DNA ในระหว่างขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์
7. SOE PCR
การต่อยีนโดยส่วนขยายที่ทับซ้อนกัน PCR (SOE PCR) ใช้ไพรเมอร์ที่มีปลายเสริมเพื่อทำให้ผลิตภัณฑ์ PCR ก่อตัวเป็นสายโซ่ที่ทับซ้อนกัน ดังนั้นในปฏิกิริยาการขยายที่ตามมา แหล่งที่มาต่างๆ ของเทคนิค A ที่ชิ้นส่วนที่ขยายจะทับซ้อนกันผ่านการขยายของสายโซ่ที่ทับซ้อนกัน และนำมาต่อเข้าด้วยกันปัจจุบันเทคโนโลยีนี้มีทิศทางการใช้งานหลักสองประการ ได้แก่ การสร้างยีนฟิวชันการกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์ของยีน
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) ใช้ไพรเมอร์เสริมแบบย้อนกลับเพื่อขยายชิ้นส่วน DNA นอกเหนือจากไพรเมอร์สองตัว และขยายลำดับที่ไม่รู้จักทั้งสองด้านของชิ้นส่วน DNA ที่รู้จัก
เดิมที IPCR ได้รับการออกแบบมาเพื่อกำหนดลำดับของบริเวณที่ไม่ทราบที่อยู่ติดกัน และส่วนใหญ่จะใช้เพื่อศึกษาลำดับของโปรโมเตอร์ของยีนการจัดเรียงโครโมโซมที่ก่อให้เกิดมะเร็ง เช่น ฟิวชั่นของยีน การโยกย้าย และการขนย้ายและการรวมยีนของไวรัสก็ใช้กันทั่วไปในปัจจุบัน สำหรับการกลายพันธุ์ที่มุ่งเป้าไปที่ไซต์ ให้คัดลอกพลาสมิดที่มีการกลายพันธุ์ที่ต้องการ
9. ดีพีซีอาร์
Digital PCR (dPCR) เป็นเทคนิคสำหรับการหาปริมาณสัมบูรณ์ของโมเลกุลกรดนิวคลีอิก
ปัจจุบันมีสามวิธีในการหาปริมาณโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกการวัดแสงขึ้นอยู่กับการดูดกลืนแสงของโมเลกุลกรดนิวคลีอิกPCR เชิงปริมาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์ (PCR แบบเรียลไทม์) ขึ้นอยู่กับค่า Ct และค่า Ct หมายถึงหมายเลขรอบที่สอดคล้องกับค่าเรืองแสงที่สามารถตรวจพบได้Digital PCR เป็นเทคโนโลยีเชิงปริมาณล่าสุดที่ใช้วิธี PCR โมเลกุลเดี่ยวสำหรับการนับปริมาณกรดนิวคลีอิกเป็นวิธีเชิงปริมาณสัมบูรณ์
เวลาโพสต์: 13 มิ.ย.-2023